賽默飛實時熒光定量PCR儀的工作流程

賽默飛實時熒光定量PCR儀（如ViiA™ 7、7500、QuantStudio系列）以其高精度和多功能性廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)實驗。要實現(xiàn)高效、準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，遵循標(biāo)準(zhǔn)化的工作流程至關(guān)重要。以下是賽默飛實時熒光定量PCR儀的詳細(xì)工作流程，從樣品準(zhǔn)備到數(shù)據(jù)分析的每個環(huán)節(jié)均作了詳盡說明。

1. 實驗準(zhǔn)備階段

(1) 樣品準(zhǔn)備

1. 核酸提取：

• 從細(xì)胞、組織或其他樣品中提取目標(biāo)DNA或RNA模板。

• 如果是RNA樣本，需使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。

• 確保核酸的純度和濃度符合實驗要求（如無抑制劑殘留）。

2. 樣品定量與質(zhì)量檢測：

• 使用分光光度計或熒光計檢測核酸濃度和純度（260/280比值在1.8-2.0之間）。

• 通過電泳確認(rèn)樣品完整性。

(2) 配制PCR反應(yīng)體系

1. 選擇試劑：

• 根據(jù)實驗需求選擇熒光染料法（如SYBR Green）或熒光探針法（如TaqMan探針）。

2. PCR反應(yīng)混合液配制：
   按以下配比準(zhǔn)備PCR反應(yīng)液（總反應(yīng)體積10-50 μL）：

• 模板DNA或cDNA（1-100 ng）；

• 引物（正向和反向，引物濃度一般為200-500 nM）；

• 熒光染料或探針（探針濃度一般為100-200 nM）；

• dNTPs、Taq DNA聚合酶和緩沖液；

• 去離子水補(bǔ)足反應(yīng)體積。

3. 分裝反應(yīng)液：

• 將PCR反應(yīng)液分裝至96孔或384孔光學(xué)反應(yīng)板中，每孔體積一致，避免氣泡產(chǎn)生。

• 進(jìn)行密封（使用光學(xué)透明薄膜或封板蓋）并短時間離心，使反應(yīng)液集中到底部。

(3) 儀器檢查

1. 檢查儀器是否已正確連接到電源和電腦。

2. 打開儀器軟件，確保光學(xué)模塊和溫控模塊運行正常。

3. 檢查反應(yīng)板對齊是否正確，避免樣品孔偏移影響熒光信號采集。

2. 實驗運行階段

(1) 加載反應(yīng)板

1. 打開儀器樣品艙門，將密封好的反應(yīng)板或試管架放置在托盤上。

2. 確保反應(yīng)板正確對齊，避免孔位偏移影響光學(xué)檢測。

(2) 設(shè)置實驗參數(shù)

在賽默飛軟件（如QuantStudio或7500軟件）中進(jìn)行實驗設(shè)置：

1. 實驗類型選擇：

• 絕對定量：用于精確定量目標(biāo)核酸。

• 相對定量：用于基因表達(dá)變化分析。

• 熔解曲線分析：檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性或突變分析。

• 根據(jù)實驗?zāi)繕?biāo)選擇適合的實驗類型，如：

2. 樣品信息輸入：

• 定義樣品名稱、分組信息和孔位分布。

• 設(shè)置目標(biāo)基因和參考基因的信息。

3. 熒光通道設(shè)置：

• 根據(jù)熒光探針或染料選擇檢測通道（如FAM、VIC、SYBR Green等）。

4. 熱循環(huán)程序設(shè)置：
   常規(guī)PCR循環(huán)參數(shù)如下：

• 變性：95℃，15秒；

• 退火/延伸：60℃，30秒；

• 初始變性：95℃，2分鐘；

• 循環(huán)階段（重復(fù)30-40次）：

• 熔解曲線分析（如適用）：從60℃升溫至95℃，每0.5℃記錄熒光信號。

(3) 啟動實驗

1. 確認(rèn)所有參數(shù)無誤后，點擊 “運行實驗"。

2. 儀器開始循環(huán)加熱并實時采集熒光信號，生成擴(kuò)增曲線。

3. 實驗完成與數(shù)據(jù)分析階段

(1) 檢查實驗完成狀態(tài)

• 儀器完成實驗后，軟件會提示實驗成功完成。

• 取出反應(yīng)板并安全存放，以備后續(xù)驗證或重復(fù)實驗。

(2) 數(shù)據(jù)分析

1. 查看擴(kuò)增曲線：

• 檢查擴(kuò)增曲線是否呈現(xiàn)典型的S形曲線，確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)的有效性。

• 平穩(wěn)的S形曲線表明擴(kuò)增反應(yīng)正常。

2. Ct值計算：

• Ct值（Threshold Cycle）是熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。Ct值越小，說明模板起始量越高。

• 軟件會自動計算每個樣品的Ct值。

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（用于絕對定量）：

• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算未知樣品的濃度。

4. 相對定量分析：

• 比較目標(biāo)基因與參考基因的表達(dá)水平，計算相對表達(dá)量（通常使用ΔΔCt法）。

5. 熔解曲線分析（用于SYBR Green染料法）：

• 檢查擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。單一峰值表明擴(kuò)增特異性良好；多峰值可能提示非特異性擴(kuò)增或引物二聚體形成。

(3) 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與保存

• 將實驗數(shù)據(jù)保存為軟件支持的文件格式（如 .eds 或 .xls），便于后續(xù)分析和報告撰寫。

4. 儀器清理與維護(hù)

(1) 清理樣品托盤

• 實驗完成后，用無塵布清潔樣品托盤，確保無殘留液體或雜質(zhì)。

(2) 光學(xué)模塊清潔

• 每周用光學(xué)專用清潔液輕輕擦拭光學(xué)窗口，避免灰塵或指紋干擾熒光檢測。

(3) 定期校準(zhǔn)

• 每3-6個月校準(zhǔn)一次溫控模塊和光學(xué)檢測系統(tǒng)，確保儀器性能穩(wěn)定。

5. 注意事項

1. 樣品制備：

• 確保核酸樣品無污染，提取過程使用無RNase、無DNase的耗材。

• 模板濃度適中，避免過量或過稀導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

2. 試劑配制：

• 使用新鮮的試劑，避免因試劑降解導(dǎo)致實驗失敗。

3. 儀器環(huán)境：

• 將儀器放置在干燥、無振動的實驗環(huán)境中，保持室內(nèi)溫度和濕度穩(wěn)定。

4. 操作規(guī)范：

• 密封反應(yīng)板時，確保無氣泡干擾光學(xué)檢測。

• 運行實驗時避免中途打開樣品艙門。

總結(jié)

賽默飛實時熒光定量PCR儀的工作流程涵蓋樣品準(zhǔn)備、儀器設(shè)置、實驗運行和數(shù)據(jù)分析等多個環(huán)節(jié)。通過嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作流程和注意事項，用戶可以充分利用儀器的高靈敏度和高精度特點，獲得可靠的實驗數(shù)據(jù)。同時，定期維護(hù)和校準(zhǔn)儀器可以確保長期穩(wěn)定的性能，為實驗室研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。