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Data download賽默飛熒光定量PCR儀(如 QuantStudio 系列、ABI 7500 系列)廣泛用于基因表達分析、病原體檢測、基因分型等實驗。以下是熒光定量PCR儀的標(biāo)準(zhǔn)操作方法,幫助您完成實驗。
確定實驗?zāi)繕?biāo):
基因表達定量、病原體檢測、SNP分析等。
選擇合適的試劑體系:
使用 TaqMan 探針、SYBR Green 染料或其他符合實驗需求的反應(yīng)體系。
樣本模板(如 DNA、RNA 經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的 cDNA)。
引物和探針(設(shè)計特異性高的引物和探針)。
PCR 反應(yīng)試劑(如 Taq 酶、dNTPs)。
PCR 反應(yīng)板(96孔或384孔,依儀器型號選擇)或 PCR 管。
無菌操作工具(如移液器、濾芯吸頭)。
確保熒光定量PCR儀已正確連接電源并開機。
檢查儀器是否校準(zhǔn),包括光學(xué)通道和溫控模塊。
清潔樣本托盤,避免污染。
成分 | 體積(µL) | 說明 |
---|---|---|
樣本模板 | 1-2 | 根據(jù)實驗需求調(diào)整濃度和體積 |
引物對(10 µM) | 0.4-1.0 | 每對引物(正向和反向) |
探針或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探針或 SYBR Green 染料 |
PCR 反應(yīng)緩沖液 | 10 | 含 Mg2?、dNTPs 等 |
Taq DNA 聚合酶 | 0.5 | 熱穩(wěn)定酶,支持實時擴增 |
無核酸酶水 | 調(diào)至總量 20 µL | 確保反應(yīng)體系最終體積正確 |
在無菌環(huán)境下混合所有反應(yīng)成分,輕輕振蕩均勻,避免氣泡產(chǎn)生。
將混合好的反應(yīng)液分裝至 96 孔 PCR 板或 0.2 mL PCR 管中。
在每個孔/管上覆蓋光學(xué)透明封板或封膜,防止蒸發(fā)。
確保每孔的體積一致,以避免離心過程中不平衡。
按儀器型號啟動,如 QuantStudio 系列或 ABI 7500 系列。
打開儀器配套軟件(如 QuantStudio Design and Analysis 軟件)。
選擇實驗類型:
絕對定量實驗:檢測樣本中靶基因的絕對拷貝數(shù)。
相對定量實驗:研究靶基因在不同樣本中的表達水平。
溶解曲線分析:用于區(qū)分特異性擴增和非特異性擴增產(chǎn)物。
輸入實驗設(shè)計:
輸入靶基因和對照基因的信息。
熒光染料/探針類型(如 FAM、SYBR Green)。
選擇樣本板格式:
根據(jù)實驗需要選擇 96 孔板或 384 孔板。
設(shè)置每個孔的樣本名稱、反應(yīng)成分和靶標(biāo)信息。
設(shè)置 PCR 程序:
初始變性: 95°C,2 分鐘。
循環(huán)反應(yīng):
95°C,15 秒(變性)。
60°C,30-60 秒(退火和延伸),共 40-45 個循環(huán)。
標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)程序:
如果是溶解曲線分析,加入升溫梯度(如從 60°C 升至 95°C)。
將已封裝好的 PCR 板或 PCR 管放入儀器樣本托盤。
確保板的擺放位置正確,并關(guān)閉樣本艙門。
點擊軟件中的 "運行" 按鈕,啟動實驗程序。
儀器開始熱循環(huán)過程,同時采集熒光信號。
儀器運行期間,可實時觀察熒光信號累積曲線,監(jiān)控樣本擴增狀態(tài)。
擴增曲線:分析每個樣本的熒光信號累積曲線,判斷 Ct 值(循環(huán)閾值)。
Ct 值分析:
定量分析靶標(biāo)的表達水平。
樣本濃度越高,Ct 值越低。
溶解曲線(SYBR Green 實驗):判斷擴增產(chǎn)物的特異性。
標(biāo)準(zhǔn)曲線分析(絕對定量實驗):根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣本濃度。
實驗完成后,通過軟件導(dǎo)出實驗數(shù)據(jù)(如擴增曲線圖、Ct 值表)。
數(shù)據(jù)可保存為 Excel、PDF 或其他格式,方便后續(xù)分析。
樣本艙清潔:
每次實驗后,用無塵布輕輕擦拭樣本托盤,去除可能的污染物。
定期清潔光學(xué)模塊(如說明書所示),確保熒光檢測靈敏度。
軟件維護:
定期更新儀器和軟件至最新版本,獲取最新功能和性能優(yōu)化。
校準(zhǔn)與檢測:
定期校準(zhǔn)儀器光學(xué)系統(tǒng)和溫控模塊,確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
如果儀器長期未使用,建議在正式實驗前進行性能驗證。
安全存儲:
關(guān)閉儀器電源,保持設(shè)備干燥。
防止樣本托盤接觸過高濕度或灰塵。
樣本準(zhǔn)備階段:
嚴(yán)格避免交叉污染。
使用無 RNA 酶、無 DNA 酶的耗材。
模板樣本濃度適中,過高會導(dǎo)致抑制擴增。
反應(yīng)體系配置:
所有操作在冰上進行,防止酶降解。
確保所有反應(yīng)組分混合均勻。
實驗運行階段:
不要隨意中斷儀器運行,避免影響實驗數(shù)據(jù)。
保證實驗室環(huán)境穩(wěn)定,避免震動或電力波動。
賽默飛熒光定量PCR儀的使用主要包括 樣本準(zhǔn)備、反應(yīng)體系配置、儀器參數(shù)設(shè)置、運行程序以及數(shù)據(jù)分析 等五個核心環(huán)節(jié)。嚴(yán)格按照操作規(guī)范可以有效提高實驗的成功率和數(shù)據(jù)的可靠性。實驗完成后,定期維護儀器可確保其長期穩(wěn)定運行。