賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀操作規(guī)程

以下是 賽默飛 QuantStudio Q5 實時熒光定量PCR儀 的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。此規(guī)程涵蓋實驗前準(zhǔn)備、儀器操作、實驗設(shè)置、運行和數(shù)據(jù)分析的步驟。

1. 實驗前準(zhǔn)備

1.1 儀器檢查

1. 確保儀器接通電源并處于正常工作狀態(tài)。

2. 打開 QuantStudio Q5 儀器和配套的軟件系統(tǒng)。

3. 檢查儀器光學(xué)模塊是否清潔，無塵無污染。

4. 確認實驗室環(huán)境穩(wěn)定（溫度20-25°C，濕度40-60%），避免灰塵干擾。

1.2 反應(yīng)材料準(zhǔn)備

準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)所需試劑和耗材：

• 樣本模板（DNA 或 RNA 轉(zhuǎn)錄的 cDNA）。

• 引物和探針（根據(jù)靶標(biāo)基因設(shè)計）。

• 熒光定量PCR試劑（如SYBR Green Master Mix或TaqMan Master Mix）。

• 96 孔板或 0.2 mL PCR 管，以及光學(xué)透明封板或封膜。

• 無菌移液器、濾芯吸頭。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系

以下是 20 µL 體系的標(biāo)準(zhǔn)配方示例：

1.4 注意事項

1. 反應(yīng)體系混合時保持在冰上操作。

2. 混勻后輕微離心，避免產(chǎn)生氣泡。

3. 使用負對照（無模板對照）和正對照，確保實驗的可靠性。

2. 儀器操作步驟

2.1 啟動儀器

1. 打開 QuantStudio Q5 實時熒光定量PCR儀。

2. 啟動配套軟件（QuantStudio Design and Analysis Software）。

3. 選擇“新建實驗"以創(chuàng)建實驗文件。

2.2 實驗參數(shù)設(shè)置

1. 實驗類型選擇：

• 絕對定量：用于計算 DNA 或 RNA 的絕對拷貝數(shù)。

• 相對定量：用于基因表達水平比較。

• 溶解曲線分析：檢查 PCR 產(chǎn)物的特異性。

• 基因分型：分析基因突變和 SNP。

2. 板型設(shè)置：

• 根據(jù)實驗需求選擇 96 孔或 384 孔板格式。

• 為每個孔輸入樣本名稱（如標(biāo)準(zhǔn)品、未知樣本、對照組）。

3. 熒光染料設(shè)置：

• 根據(jù)使用的染料或探針設(shè)置相應(yīng)的熒光通道（如 FAM、VIC、ROX）。

• 啟用 ROX 參考染料（如果試劑中包含）。

4. 熱循環(huán)程序：

• 初始變性：95°C，2-10 分鐘。

• 循環(huán)反應(yīng)（40 次循環(huán)）：

• 95°C，15 秒（變性）。

• 60°C，30-60 秒（退火和延伸，熒光信號采集階段）。

• 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) PCR 循環(huán)程序：

• 如果需要溶解曲線分析，加入升溫梯度（如從 60°C 至 95°C）。

2.3 加載樣本板

1. 將已封裝好的 PCR 板或管放入樣本托盤。

2. 確保 PCR 板放置平穩(wěn)，并封膜牢固，避免蒸發(fā)。

3. 關(guān)閉樣本艙門，確保儀器密封。

2.4 啟動實驗

1. 檢查設(shè)置無誤后，點擊 “運行實驗"。

2. 儀器開始運行，同時采集熒光信號。

3. 在運行過程中，實時監(jiān)測擴增曲線以確認擴增反應(yīng)正常。

3. 數(shù)據(jù)分析

3.1 實時監(jiān)控

• 儀器運行時，軟件界面會顯示擴增曲線的實時變化。

• 檢查所有樣本的熒光信號是否正常累積。

3.2 Ct 值分析

• Ct 值（循環(huán)閾值）： 自動計算每個樣本的 Ct 值，Ct 值越低，樣本初始濃度越高。

• 對照標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于絕對定量計算樣本濃度。

3.3 溶解曲線分析（SYBR Green 實驗）

• 檢查 PCR 產(chǎn)物是否特異性擴增。

• 特異性擴增應(yīng)顯示單一峰值，非特異性產(chǎn)物會有多個峰值。

3.4 數(shù)據(jù)導(dǎo)出

• 將分析結(jié)果（擴增曲線、Ct 值表、溶解曲線等）保存為 Excel、PDF 或圖片格式。

• 確保實驗數(shù)據(jù)備份并存檔。

4. 實驗完成后的維護

4.1 清潔儀器

1. 實驗完成后，取出樣本板并清理托盤。

2. 用無塵布輕輕擦拭儀器內(nèi)部，防止樣本殘留。

4.2 光學(xué)模塊維護

• 定期清潔光學(xué)模塊，保持熒光檢測的靈敏度。

• 如果出現(xiàn)熒光信號異常，需校準(zhǔn)光學(xué)模塊。

4.3 溫控校準(zhǔn)

• 按照儀器使用手冊，每 3-6 個月對溫控模塊進行校準(zhǔn)，確保溫度一致性。

4.4 軟件更新

• 定期檢查軟件版本，安裝賽默飛發(fā)布的最新補丁或更新。

5. 注意事項

1. 樣本操作

• 使用無核酸酶污染的耗材和移液器。

• 避免模板 DNA 交叉污染。

2. 試劑保存

• 熒光染料和酶類應(yīng)按照試劑說明存放（如 -20°C 冷凍）。

• 使用前確保試劑混勻。

3. 實驗運行

• 在運行過程中不要隨意中斷儀器運行，防止數(shù)據(jù)丟失。

• 若出現(xiàn)異常終止，記錄故障代碼并聯(lián)系賽默飛技術(shù)支持。

總結(jié)

賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀以其靈活性和高精度著稱，是中小型實驗室開展基因定量分析的理想工具。嚴格按照操作規(guī)程（SOP）進行實驗，可提高實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，同時確保儀器的長期穩(wěn)定運行。