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Data download以下是 賽默飛 QuantStudio Q5 實時熒光定量PCR儀 的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)。此規(guī)程涵蓋實驗前準(zhǔn)備、儀器操作、實驗設(shè)置、運行和數(shù)據(jù)分析的步驟。
確保儀器接通電源并處于正常工作狀態(tài)。
打開 QuantStudio Q5 儀器和配套的軟件系統(tǒng)。
檢查儀器光學(xué)模塊是否清潔,無塵無污染。
確認實驗室環(huán)境穩(wěn)定(溫度20-25°C,濕度40-60%),避免灰塵干擾。
準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)所需試劑和耗材:
樣本模板(DNA 或 RNA 轉(zhuǎn)錄的 cDNA)。
引物和探針(根據(jù)靶標(biāo)基因設(shè)計)。
熒光定量PCR試劑(如SYBR Green Master Mix或TaqMan Master Mix)。
96 孔板或 0.2 mL PCR 管,以及光學(xué)透明封板或封膜。
無菌移液器、濾芯吸頭。
以下是 20 µL 體系的標(biāo)準(zhǔn)配方示例:
成分 | 體積(µL) | 說明 |
---|---|---|
PCR Master Mix | 10 | 含有聚合酶、dNTP、Mg2?等 |
上下游引物(10 µM) | 0.5 各 | 根據(jù)靶基因調(diào)整濃度 |
探針(10 µM)或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探針或 SYBR Green |
模板 DNA/cDNA | 1-2 | 根據(jù)樣本濃度調(diào)整體積 |
無核酸酶水 | 至 20 µL | 補足總反應(yīng)體系體積 |
反應(yīng)體系混合時保持在冰上操作。
混勻后輕微離心,避免產(chǎn)生氣泡。
使用負對照(無模板對照)和正對照,確保實驗的可靠性。
打開 QuantStudio Q5 實時熒光定量PCR儀。
啟動配套軟件(QuantStudio Design and Analysis Software)。
選擇“新建實驗"以創(chuàng)建實驗文件。
實驗類型選擇:
絕對定量:用于計算 DNA 或 RNA 的絕對拷貝數(shù)。
相對定量:用于基因表達水平比較。
溶解曲線分析:檢查 PCR 產(chǎn)物的特異性。
基因分型:分析基因突變和 SNP。
板型設(shè)置:
根據(jù)實驗需求選擇 96 孔或 384 孔板格式。
為每個孔輸入樣本名稱(如標(biāo)準(zhǔn)品、未知樣本、對照組)。
熒光染料設(shè)置:
根據(jù)使用的染料或探針設(shè)置相應(yīng)的熒光通道(如 FAM、VIC、ROX)。
啟用 ROX 參考染料(如果試劑中包含)。
熱循環(huán)程序:
初始變性:95°C,2-10 分鐘。
循環(huán)反應(yīng)(40 次循環(huán)):
95°C,15 秒(變性)。
60°C,30-60 秒(退火和延伸,熒光信號采集階段)。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) PCR 循環(huán)程序:
如果需要溶解曲線分析,加入升溫梯度(如從 60°C 至 95°C)。
將已封裝好的 PCR 板或管放入樣本托盤。
確保 PCR 板放置平穩(wěn),并封膜牢固,避免蒸發(fā)。
關(guān)閉樣本艙門,確保儀器密封。
檢查設(shè)置無誤后,點擊 “運行實驗"。
儀器開始運行,同時采集熒光信號。
在運行過程中,實時監(jiān)測擴增曲線以確認擴增反應(yīng)正常。
儀器運行時,軟件界面會顯示擴增曲線的實時變化。
檢查所有樣本的熒光信號是否正常累積。
Ct 值(循環(huán)閾值): 自動計算每個樣本的 Ct 值,Ct 值越低,樣本初始濃度越高。
對照標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于絕對定量計算樣本濃度。
檢查 PCR 產(chǎn)物是否特異性擴增。
特異性擴增應(yīng)顯示單一峰值,非特異性產(chǎn)物會有多個峰值。
將分析結(jié)果(擴增曲線、Ct 值表、溶解曲線等)保存為 Excel、PDF 或圖片格式。
確保實驗數(shù)據(jù)備份并存檔。
實驗完成后,取出樣本板并清理托盤。
用無塵布輕輕擦拭儀器內(nèi)部,防止樣本殘留。
定期清潔光學(xué)模塊,保持熒光檢測的靈敏度。
如果出現(xiàn)熒光信號異常,需校準(zhǔn)光學(xué)模塊。
按照儀器使用手冊,每 3-6 個月對溫控模塊進行校準(zhǔn),確保溫度一致性。
定期檢查軟件版本,安裝賽默飛發(fā)布的最新補丁或更新。
樣本操作
使用無核酸酶污染的耗材和移液器。
避免模板 DNA 交叉污染。
試劑保存
熒光染料和酶類應(yīng)按照試劑說明存放(如 -20°C 冷凍)。
使用前確保試劑混勻。
實驗運行
在運行過程中不要隨意中斷儀器運行,防止數(shù)據(jù)丟失。
若出現(xiàn)異常終止,記錄故障代碼并聯(lián)系賽默飛技術(shù)支持。
賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀以其靈活性和高精度著稱,是中小型實驗室開展基因定量分析的理想工具。嚴格按照操作規(guī)程(SOP)進行實驗,可提高實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性,同時確保儀器的長期穩(wěn)定運行。